la norme
Vous devez séparer et identifier les composés dans un nouveau mélange? Il n’y a pas de méthodes validées publiées précédemment dans la littérature?! Alors c’est pour vous…
Un organigramme présentant toutes les étapes pour développer une nouvelle méthode HPLC accessible par ce lien:
https://bubbl.us/?h=1b3a2d/364fb7/17rtFv8XG9eT6
Aperçu du diagramme de développement de la méthode
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Personne n’a jamais dit que la HPLC était facile.
Eh bien, c’est en fait … MAIS si vous êtes encore confus au sujet des principaux concepts et de ce qui influence quoi (et comment), voici un lien vers une carte conceptuelle qui devrait clarifier les choses:
https://bubbl.us/?h=1b3a2d/375bb2/17qY0qI6Jd3QM
Un aperçu de la carte conceptuelle HPLC
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1) À propos de l’isocratique
Lorsque la composition de la phase mobile ne change pas pendant une analyse (composition constante), la méthode est dite isocratique.
Certains problèmes peuvent être associés à ce choix de méthode, tels que:
Ces problèmes peuvent être visualisés dans le chromatogramme suivant:
Analyse isocratique
2) À propos du dégradé
De nombreux problèmes associés à la HPLC isocratique peuvent être surmontés en utilisant la CLHP en gradient. Pour cette méthode, la composition de la phase mobile est modifiée pendant l’analyse (normalement en augmentant la quantité de modificateur organique – ACN ou MeOH dans RP-HPLC).
Il convient de mentionner que l’élution en gradient est la mieux adaptée aux analyses effectuées à l’aide de phases stationnaires RP, NP et de chromatographie par échange d’ions. De plus, une pompe spéciale doit être utilisée pour permettre le mélange en ligne des composants de la phase mobile.
Principaux avantages de l’élution du gradient:
Comment ça marche?
– la composition initiale est choisie pour que la force du solvant soit appropriée non seulement pour retenir mais aussi pour résoudre les analytes à élution précoce;
– une fois la composition initiale établie, la concentration en modificateur organique est augmentée de manière prédéterminée pour éluer les composés;
– la composition finale de la phase mobile est choisie pour garantir une élution de tous les composés avec une résolution optimale et dans un délai raisonnable;
– Il est également possible d’augmenter le modificateur organique pour éliminer les composés fortement retenus susceptibles de contaminer la colonne.
Inconvénients d’une méthode Gradient:
L’étude de cas suivante montre comment l’élution progressive peut être plus avantageuse que les élutions isocratiques:
Etude de cas pour Gradient
Comme on peut le voir, une élution Gradient a fourni de meilleurs pics résolus, avec des hauteurs et une sélectivité acceptables, et un temps d’exécution plus court. L’élution isocratique n’a pas été achevée avant près de 75 minutes d’exécution, et le dernier pic est large, ce qui n’est pas souhaitable.
Gardez à l’esprit: Les plus grandes molécules sont plus sensibles que les petites molécules aux modifications du modificateur% organique
L’équation ci-dessous explique comment calculer le facteur de rétention k pour une méthode de gradient en HPLC, où:
Équation
Comment fonctionne l’élution Gradient?
– Généralement, deux solvants sont utilisés (réservoirs A et B). Le réservoir A contient généralement le solvant le plus faible.
– La force d’élution augmente généralement avec le temps.
– Le mélange de la composition de la phase mobile est réalisé à l’aide de la pompe HPLC et deux méthodes de mélange sont courantes. Le premier est le mélange à basse pression , dans lequel les solvants sont proportionnés du côté basse pression de la pompe à l’aide d’ électrovannes . La seconde approche est connue sous le nom de mélange sous haute pression et se produit lorsque deux pompes ou plus sont utilisées pour distribuer des solvants à différents débits dans une chambre de mélange.
– Parfois, les solvants peuvent être prémélangés ou « dopés » pour faciliter le mélange des solvants (le solvant A contient 5% de solvant B et vice-versa).
Quelques principes importants d’élution du gradient:
– L’élution par gradient est particulièrement utile pour la chromatographie HPLC en phase inverse et la chromatographie par échange d’ions.
– Le gradient réel est formé en augmentant le pourcentage de modificateur organique (%).
– A cause de cela, au début de l’analyse, lorsque la force de la phase mobile est faible, les composés seront entièrement répartis dans la phase stationnaire (tête de la colonne).
– Au fur et à mesure que la force de la phase mobile augmente, l’analyte commence à se répartir dans la phase mobile et se déplace le long de la colonne. Une certaine accélération sera générée lorsque la concentration en modificateur organique (%) est augmentée.
– À un moment donné pendant l’élution, les composés seront complètement répartis dans la phase mobile (en fonction de certaines variables telles que la longueur de la colonne). Au cours de cette étape, les composés se déplaceront à la même vitesse que la phase mobile, elle-même déterminée par le débit et la vitesse linéaire.
– Il est important de noter que nous ne pouvons pas affecter une valeur k (facteur de rétention) fixe à un composé lorsque l’élution Gradient est appliquée, car elle change tout au long de l’élution. Il est faux de calculer k en utilisant l’équation k = (tr-t 0 ) / t 0 , elle ne peut être appliquée qu’à l’élution isocratique.
La figure suivante montre comment l’élution du gradient fonctionne dans une colonne .
Que se passe-t-il à l’intérieur de la colonne pendant un dégradé?
Région A – Tête de la colonne (où les composés seront retenus au début du cycle, lorsque le pourcentage de modificateur organique est faible)
Région B – La région où l’on observe une certaine accélération des composés en raison de l’augmentation du modificateur organique (%)
Région C – Région où les composés se sont entièrement répartis dans la phase mobile et se déplacent et sa vitesse.
Le graphique ci-dessous montre comment le modificateur organique et le facteur de rétention changent avec le temps pendant une élution du gradient:
Comment le facteur de rétention change en fonction de% B au cours d’un dégradé
Le graphique du haut détaille le profil du gradient et, au fil du temps, plus de modificateur organique est présent dans la phase mobile, ce qui nous amène au graphique inférieur, où nous pouvons voir comment les composés commencent à être presque entièrement conservés dans la colonne commence à diminuer au fur et à mesure que le temps (et le modificateur organique) augmente.
Forme de pointe en HPLC dégradée
Dans des conditions isocratiques, il n’est pas rare de voir l’élargissement de la bande et les pics avec une plus grande largeur avec un temps de rétention accru. Ce n’est pas un problème pour l’élution du gradient due à la vitesse des composés pendant l’élution. À un moment donné, les analytes vont accélérer à travers la colonne (avec un% de modificateur organique) et générer des pics plus étroits, qui sont souhaités. La différence de temps de rétention entre les composés est naturellement une conséquence de la quantité de modificateur organique dont ils ont besoin pour commencer à accélérer. Cela change en fonction de chaque composé et dépend de leurs propriétés physico-chimiques.
Le terme de focalisation du pic peut être appliqué à l’élution du gradient.
La focalisation du pic peut également être attribuée à l’arrière et à la queue du pic à des compositions de phase mobile légèrement différentes tout au long du cycle.
Mise au point maximale
Mise au point maximale
Qu’est-ce qu’un dégradé de scoutisme?
Le gradient de dépistage est un gradient linéaire de 5 à 10% de B à 100% de B, généralement pendant 20 minutes. Pour RP-HPLC, l’eau et l’ACN sont généralement les éluants de choix. C’est un bon outil à utiliser pour développer une méthode isocratique ou en gradient.
Si les composés éluent pour plus de 25% du temps après la fin du gradient, puis un solvant plus fort B est requise, ou d’ une colonne inférieure de rétention, de sorte que les composés peuvent partitionner plus dans la phase mobile et éluer rapidement.
L’utilisation d’un gradient de reconnaissance peut être utile et révèle beaucoup sur la composition de phase mobile requise pour la séparation.
Pente raide
La pente du gradient peut être vue dans la figure ci-dessous:
Pente raide
La pente du gradient est naturellement contrôlée par la composition de début et de fin de la phase mobile, ainsi que par le temps de gradient.
La pente du gradient peut également être déterminée par 1 / k
Comment manipuler l’équation du gradient pour optimiser la séparation?
L’équation du facteur de rétention du gradient peut être examinée plus avant afin d’améliorer la séparation des gradients. Si l’on cherche à augmenter le facteur de rétention du gradient, ils peuvent:
Cela ne garantit toutefois pas que la résolution sera améliorée à 100%.
Quelques considérations pratiques concernant le dégradé:
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Notes sur la silice en phase stationnaire :
La silice est souvent utilisée comme matériau de support pour l’adsorption en HPLC en phase normale et avec une modification chimique pour HPLC en phase inverse (partition) et d’autres types de chromatographie.
La silice poreuse a une surface spécifique élevée qui conduit à un rendement élevé grâce à un nombre plus élevé de plateaux théoriques.
Certains facteurs à prendre en compte pour la fabrication des colonnes à base de silice sont la pureté, la forme, la taille des particules et la distribution granulométrique.
Pourquoi ces facteurs sont-ils importants? La présence d’ions métalliques dans la silice peut entraîner un pic de fuite. Donc, ce qui se passe est une « rétention secondaire indésirable » qui provient des molécules d’analyte interagissant avec les groupes de métal ou de silanol sur la surface de la silice, conduisant à une rétention plus longue. De plus, les ions métalliques de surface agissent comme agents chélatants pour retenir les molécules d’analyte. Le fer et l’aluminium sont particulièrement gênants. Une façon de minimiser cela est de « laver à l’acide » la silice.
Pourquoi ces facteurs sont-ils importants? Bien que les particules irrégulières soient moins coûteuses, elles sont moins efficaces que les particules sphériques. Cela est dû à la manière dont les particules se rangent dans la colonne HPLC. Cela conduit à une perte d’efficacité (élargissement de la bande) principalement en raison de plus d’effets de diffusion de Foucault et de transfert de masse.
À pH élevé, le substrat de silice est susceptible de subir une hydrolyse, ce qui entraîne une dégradation. Les symptômes typiques de ceci sont une perte d’efficacité et une augmentation de la contre-pression.
Une réponse à cela: les matériaux hybrides. Ils sont formés à partir d’un mélange d’alkylsiloxane (organique) et de silane (inorganique). Ces matériaux présentent une bonne stabilité à pH élevé en diminuant la sensibilité à l’hydrolyse.
L’image ci-dessous résume tous les facteurs les plus importants à prendre en compte pour les colonnes HPLC à base de silice:
Notes sur les phases chimiquement liées
La composition fondamentale de la silice utilisée pour HPLC est SiO 2 .xH 2 0 . Le groupe silanol est celui dans lequel les phases liées chimiquement sont attachées.
Un moyen de modifier la sélectivité consiste à modifier la chimie de la phase stationnaire. L’une des façons les plus courantes de le faire consiste à faire réagir un chlorosilane avec les groupes silanols de surface, en produisant un certain nombre de phases stationnaires différentes selon qu’il s’agit d’un mono, d’un di ou d’un trichlorosilane.
Les mono produisent des matériaux d’emballage monomères , se fixant à la surface de la silice par une simple liaison.
Bien qu’ils soient très efficaces, ils ne sont pas aussi robustes que ceux produits par le di et tri-chlorosilane. Ces phases liées sont appelées « phases polymères liées ». Ils sont utiles car en modifiant la chimie de surface, ils modifient la sélectivité de la colonne.
La figure ci-dessous montre les voies de synthèse pour synthétiser des phases polymères liées:
Notes sur le traitement de surface et le recouvrement
Même si la plupart des fabricants font du bon travail en fournissant de bonnes phases liées (matériaux hybrides), il y a toujours quelques groupes silanol qui n’ont pas réagi en raison d’effets stériques.
Ces groupes silanols restants (en fonction de leur conformation) réagiront avec des molécules contenant des groupes fonctionnels ioniques ou polaires et conduiront à un pic de rétention (rétention / interaction secondaire indésirable)
Comment se débarrasser de ce problème? En recouvrant la surface de la colonne, on fait réagir les groupes silanol avec un agent qui recouvre la surface polaire. Cela se fait à l’aide d’un groupe non polaire, tel que le triméthylsilyle (TMS).
Considérations importantes sur la conformation du silanol: toutes les différentes conformations interagissent avec des groupes fonctionnels ioniques et polaires de molécules à différents degrés. Par exemple, les groupes acidi (ou solitaires) silanol offrent la plus forte interaction et conduisent donc à la pire pointe de résidus. Ainsi, la conformation du groupe silanol peut être un facteur de changement de la sélectivité de la colonne.
Comme on pouvait s’y attendre, le maximum de résidus sera pire quand une interaction entièrement ionique se produira entre ces groupes, et cela dépend naturellement du pH (car cela affecte le degré d’ionisation des deux espèces).
Comme nous pouvons le constater, le fait de lier chimiquement la phase stationnaire et le recouvrement final sont des moyens de réduire la rétention indésirable et de modifier la sélectivité.
L’image ci-dessous détaille le fonctionnement du recouvrement:
Notes sur le silanol et la séparation
Des groupes de silanols isolés (acides) peuvent conduire à un pic de rétention et à une rétention irréversible. Cependant, il est également possible d’utiliser la surface de silanol pour conférer des attributs de sélectivité spécifiques à une séparation.
En contrôlant l’espacement des ligands de la phase liée, le degré d’influence que les espèces de silanol exercent sur la séparation peut être contrôlé.
Notes sur les phases mouillables à l’eau
Les colonnes à inversion de phase traditionnelles ne conviennent pas aux phases mobiles hautement aqueuses (> 95% H 2 0), en raison d’un phénomène connu sous le nom de « collapsus de phase » ou « auto-association ».
Comment se passe l’effondrement de phase? En modifiant l’hydrophilie de la phase mobile, les ligands C8 et C18 s’auto-associent pour minimiser l’énergie d’interaction avec la phase mobile, entraînant de grandes pertes d’efficacité.
Il existe différentes méthodes pour produire une phase stationnaire mouillable à l’eau (pour HPLC RP). L’une d’elles implique un contrôle étroit de l’espacement entre les ligands de la phase liée sur la surface de la silice. Si nous connaissons la surface de la silice et ajustons la charge de carbone, nous pouvons modifier la sélectivité de la séparation.
Comment la stabilité est-elle atteinte dans ce cas? – Adsorption d’une couche d’eau sur la surface de silice. Les groupes silanols à basse énergie (conformation vicinale) s’hydratent et la force motrice de l’auto-association est perdue car les chaînes vont se repousser à cause de la couche d’eau qui est efficacement adsorbée.
Un autre moyen d’obtenir une stabilité dans une phase mobile aqueuse à 100% consiste à utiliser des réactifs de coiffage d’extrémité polaire. Le mécanisme est similaire au précédent, où la couche d’eau empêche l’effondrement de la phase et modifie de manière significative la sélectivité de la colonne.
La figure ci-dessous est une représentation de ce mécanisme:
Mécanisme pour les phases mouillables de l’eau
Phases incorporées polaires : ces phases contiennent une modification de la chaîne alkyle, qui est habituellement un amide, un carbamate ou un autre groupe polaire approprié. Certains des avantages sont les suivants: utilisation avec des phases mobiles aqueuses à 100%; aptitude à séparer les composés polaires, ionisables et particulièrement basiques avec une efficacité et une forme de pic excellentes; robustesse accrue.
Travailler à faible pH
A faible pH, le risque est dû à l’hydrolyse de la liaison éther entre la phase liée et la surface de silice. Cela se voit à travers la détérioration de la forme de pointe et la perte d’efficacité.
Les fabricants offrent maintenant des choix de phase stationnaires pouvant fonctionner à un pH faible. Ils le font en ajoutant des groupes latéraux volumineux sur le ligand pour offrir une protection stérique de la liaison éther.
Travailler à faible pH
Travailler à pH élevé
A pH élevé, la surface de silice présente un risque, une fois susceptible de s’hydrolyser des groupes silanols de surface.
Cette hydrolyse potentielle peut éventuellement conduire à la formation de très petites particules (fines) qui migrent vers et bloquent la fritte de sortie, conduisant à une contre-pression accrue. Cela peut également être vu par la perte de forme de crête et l’élargissement de la bande.
Certaines approches pour surmonter ce problème comprennent: l’utilisation de la silice hybride qui contient moins de groupes silanols de surface; en utilisant un matériau à base de polymère et de non-silice.
Certains avantages du travail à pH élevé sont les suivants: élimination du degré d’ionisation de l’analyte (ce qui signifie qu’il ne sera pas nécessaire d’ajuster le pH de la phase mobile); augmente la robustesse et la rétention de la méthode pour les analytes basiques élevés.
La figure ci-dessous illustre les moyens de surmonter l’hydrolyse de la silice due à un pH très élevé:
Travailler à pH élevé
LA BOITE ~ MYSTIEUSE ~ USLC
Chromatographie liquide ultra sélective (USLC)
Cette boîte contient la plus large gamme de sélectivité de phase inversée disponible, avec quatre phases stationnaires différentes:
– C18 aqueux
– IBD (à base intrinsèque désactivée)
– biphényle
– PFP Propyl
Les détails de chacune de ces colonnes en ce qui concerne les dimensions et la taille des particules peuvent être trouvés ici: http://www.restek.com/Landing-Pages/USLC-sup-reg-sup-Columns-Ultra-Selective-Liquid-Chromatography
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Le NOMOGRAM
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L’équation de Van Deemter
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Effet du pH:
Dans un environnement acide (phase mobile), les médicaments / composés acides seront principalement syndiqués (forme moléculaire), tandis que les médicaments / composés de base seront ionisés. En revanche, dans les environnements basiques, les composés acides seront principalement des composés ionisés et basiques sous forme moléculaire. Il convient de noter que cela dépend également du pkA / pkB.
Effet de la température:
Effet de la température
Selon l’image ci-dessus, une augmentation de la température réduira généralement la valeur de k, donc le temps de rétention réel diminuera et la séparation ne sera pas aussi efficace.
Il y a deux autres effets significatifs de la séparation sous la température élevée:
